【分子】荧光定量PCR(一) | 合法醫療器材資訊網
2020年1月19日—反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成cDNA的过程。依据样本浓度,计算同样含量的RNA进行反转录,得到cDNA用无菌ddH2O稀释十倍,混匀后分装冻存。
文章来自GongZH:[植为一生]
一、Total RNA的提取与检测(Trizol法)
1.Total RNA的提取
表1 RNA提取的流程:取样→裂解→抽提→沉淀→洗涤→干燥→溶解
2.Total RNA的检测:定性+定量
(1) 定性检测:琼脂糖凝胶电泳
①配体系:10 μL体系,8 μL DEPC水,1 μL待测样品,1 μL Loading Buffer。
②跑电泳:用DEPC水配制1×TAE电泳缓冲液,同时制备1%含核酸染料的琼脂糖凝胶。100 V恒压电泳20 min后于照胶仪中观察。
③看条带电泳结果纯的无降解的RNA有3条带,由上到下依次为:28S、18S、5S。其中5S条带很弱正常。若其他条带亦很弱,且有拖尾,则RNA可能发生降解。若加样孔亦有条带,则可能发生基因组DNA残留。
(2) 定量检测:Nanodrop开机→用RNase水洗两遍→打开程序,选单位ng/μl →滴加RNase水2.5 μL→点击 blank→滴加样品1 μL→点击measure(重测时先水洗)。
RNA在260 nm处有最大吸收峰,当OD260=1.0时,溶液中含有40 μg/mL RNA。OD260/280=2.0时,RNA纯度较高。比值较小,有蛋白质污染;比值较大,有RNA降解。
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