【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题(页1) | 合法醫療器材資訊網
一般提取组织后测RNA的浓度,然后反转录的时候保证reactionmixture里面RNA的量是一样的。然后你反转录成了cDNA。这个时候不必要测浓度。因为你的反转录 ...
2015-6-3 17:15 中国特色
【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题[size=2]做realtime有段时间了,现在有几个疑问请教大家, 一般提取组织RNA后都会测量浓度,然后根据RNA浓度调整体积,使得进行转录的RNA总量一致,最后得到的cDNA就不再测浓度,直接加1ul进入25ul的Sybrgreen反应体系。 但是即使加入的RNA量一致,但是转录后得到的cDNA量都是有差别的,我最近测了一批cDNA浓度,样本间的差异比较多,现在的问题是:我是否需要根据cDNA的实际浓度调整加进去的cDNA溶液体积,使得实际每管cDNA的量相同? 还有个问题就是:因为只要相对表达量,每个基因都有要和管家基因相比较,这样一来是不是其实真正加多少cDNA进去并不重要了,因为最后都会normalized by housekeeping gene? 这两个问题想了很久,想听听大家的意见[/size]
2015-6-3 17:15 am10
[size=2] 个人不是特别赞同你的“一般提取组织RNA后都会测量浓度,然后根据RNA浓度调整体积,使得进行转录的RNA总量一致”这一做法。如果做很多,那岂不是很麻烦。而且似乎根本无法保证RNA浓度都在同一起跑线上。 我的解决办法就是同时作内参的表达量然后计算相对表达量[/size]
2015-6-3 17:15 2541
[size=2]是这样。一般提取组织后测RNA的浓度,然后反转录的时候保证reaction mixture里面RNA的量是一样的。然后你反转录成了cDNA。这个时候不必要测浓度。因为你的反转录体系都是一样的,理论上讲(建议用multipipetide)你生成的cDNA也是一样的。 我最近也在想为什么cDNA的浓度不一样。楼主我们再讨论。我觉得...
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