[求救] western blot壓出空白片 | 合法醫療器材資訊網
我最近在做westernblot我大學到研究所期間都做過westernblot都有做...二抗anti-mouse1:5000暗房壓片ECL作用3分鐘壓片5分鐘底片超乾淨 ...
作者sunnyandsund (sunny)
看板Biotech
標題[求救] western blot壓出空白片
時間Sat Jan 20 23:53:33 2018
我最近在做western blot 我大學到研究所期間都做過western blot 都有做出結果 現在到其他實驗室做WB卻做不出來 實驗室的人幾乎都做過WB 只是不是在這間實驗室做的 是在其他實驗室做的 所以東西藥品是舊的 細胞蛋白抽取後測完濃度冰到-80 然後加6X sample buffer煮5分鐘 loading到10% SDS PAGE上膠80V 下膠120V marker有分開 transfer buffer 是用tris和glycine也有加20% methanol和0.4% SDS transfer用biorad 的tank 條件是300mA 1.5hr 轉到NC membrane上 marker每條都有轉過去 然後因為之前第一次做的時候也是都空白片 所以這次有用ponceus S染膜 卻沒染出任何東西 我們沒有染膠 因為沒有comasin blue 然後就5% milk blocking 一抗目標抗體1:1000 overnight 二抗anti-mouse 1:5000 暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片5分鐘 底片超乾淨 沒東西 strip後 blocking 1hr 1Ab anti-bactin 1:5000 overnight 4度C 2ab anti-mouse 1:5000 1hr RT TBST wash 三次 十分鐘後 暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片10分鐘 底片很乾淨沒東西 想問這是什麼問題? 還有因為我以前都是用PVDF膜 但這裡是用NC的 我的transfer條件是用以前的方式 想問NC的transfer 條件是? 就是關於時間和安培的部分 謝謝 我真的做到快崩潰 希望大家解救阿 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.132.101.105 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1516463615....Western blotting | 合法醫療器材資訊網
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