核酸萃取之試劑純化與比較 | 合法醫療器材資訊網
2017年12月1日—在上述文章中有提到,核酸萃取的方法有很多中,常見的有:試劑萃取、管柱萃取以及磁珠萃取,今天主要介紹試劑萃取,試劑萃取又因溶劑的 ...
在上述文章中有提到,核酸萃取的方法有很多中,常見的有:試劑萃取、管柱萃取以及磁珠萃取,今天主要介紹試劑萃取,試劑萃取又因溶劑的不同,分作有機溶劑萃取與非有機溶劑萃取。
其基本原理如下[1]:
DNA為一個容易變性或斷裂的巨分子,而細胞內的DNA水解酶更會破壞其結構,因此在萃取DNA時,會將細胞溶解後置於相似細胞環境的緩衝溶液中,透過金屬螯合劑降低DNA水解酶的活性,再利用蛋白變性劑將附著在DNA上的蛋白分開,接著透過有機溶劑(或無機溶劑)去除蛋白質及其他雜質(圖一),因DNA具親水性而不溶於有機溶劑(如:phenol/chloroform)中,因此可以透過分層,主要分三層,包含水層(DNA)、蛋白質及有機溶液層(圖二),而萃取出DNA [1]。
圖一、利用有機溶劑去除雜質[2]
圖二、利用phenol:chloroform萃取後的分層[2]
有機溶劑萃取主要的步驟如下[1]:
將細胞溶解後,加入DNA萃取緩衝液(DNA extraction buffer)及蛋白水解酶K (proteinase K),於65℃反應3~4個小時,接著於室溫下再加入PCI (phenol:chloroform : IAA = 25:24:1)讓萃取物分層,緩慢上下混合5分鐘,再以13000 rpm轉速離心5分鐘(25℃),取上清液至新的eppendorf,再加入PCI緩慢上下混合均勻5分鐘,以13000 rpm轉速離心5分鐘(25℃),取上清液再加入CI (chloroform:IAA = 24:1 ) 緩慢上下翻轉5 min,以13000 rpm轉速離心5分鐘(4℃),取上清液置入新的eppendorf後加入NaOAc與isopropanol的混合液,置於-8...
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