核酸萃取之試劑純化與比較 | 合法醫療器材資訊網

2017年12月1日—將細胞溶解後，加入DNA萃取緩衝液(DNAextractionbuffer)及蛋白水解酶K(proteinaseK)，於65℃反應3~4個小時，接著於室溫下再加入PCI(phenol:chloroform ...

    在上述文章中有提到，核酸萃取的方法有很多中，常見的有：試劑萃取、管柱萃取以及磁珠萃取，今天主要介紹試劑萃取，試劑萃取又因溶劑的不同，分作有機溶劑萃取與非有機溶劑萃取。

其基本原理如下[1]：

    DNA為一個容易變性或斷裂的巨分子，而細胞內的DNA水解酶更會破壞其結構，因此在萃取DNA時，會將細胞溶解後置於相似細胞環境的緩衝溶液中，透過金屬螯合劑降低DNA水解酶的活性，再利用蛋白變性劑將附著在DNA上的蛋白分開，接著透過有機溶劑(或無機溶劑)去除蛋白質及其他雜質(圖一)，因DNA具親水性而不溶於有機溶劑(如：phenol/chloroform)中，因此可以透過分層，主要分三層，包含水層(DNA)、蛋白質及有機溶液層(圖二)，而萃取出DNA [1]。

圖一、利用有機溶劑去除雜質[2]

圖二、利用phenol:chloroform萃取後的分層[2]

有機溶劑萃取主要的步驟如下[1]：

    將細胞溶解後，加入DNA萃取緩衝液(DNA extraction buffer)及蛋白水解酶K (proteinase K)，於65℃反應3~4個小時，接著於室溫下再加入PCI (phenol:chloroform : IAA = 25：24：1)讓萃取物分層，緩慢上下混合5分鐘，再以13000 rpm轉速離心5分鐘(25℃)，取上清液至新的eppendorf，再加入PCI緩慢上下混合均勻5分鐘，以13000 rpm轉速離心5分鐘(25℃)，取上清液再加入CI (chloroform:IAA = 24：1 ) 緩慢上下翻轉5 min，以13000 rpm轉速離心5分鐘(4℃)，取上清液置入新的eppendorf後加入NaOAc與isopropanol的混合液，置於-8...