原位雜合技術(In situ hybridization;ISH) | 合法醫療器材資訊網
2018年5月17日—ISH的原理其實和南方墨點法(Southernblotting)類似,都是利用核酸...為螢光原位雜合技術(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)。
原位雜合技術 (In situ hybridization;ISH) 臺灣大學生命科學所 霍其嶸
原位雜合(下簡稱為:ISH)是一種被廣泛使用來確認組織及細胞中特定DNA或是RNA表現位置的方法。最早是由美國生物學家Mary-Lou Pardue跟Joseph G. Gall在1969年所發明的。當生物體的個體不是很大時,可以在不進行切片或是分離的狀況下進行染色,這種做法稱之為全標本包埋原位雜合(Whole – mount in situ hybridization, WISH)。
ISH的原理其實和南方墨點法(Southern blotting)類似,都是利用核酸序列會互補的特性來設計探針(probe)去標定互補(Complementary)DNA或RNA。RNA探針必須要能夠和生物體的RNA進行互補結合,所以使用的序列為反股RNA(antisense RNA),正股的探針因為和組織或是細胞內所含有的RNA相同,所以無法進行互補,故常被用來做為陰性對照組(Negative control)。
DNA或是RNA探針和序列互補結合之後,會利用抗體去辨識及呈色。為了要讓抗體可以辨識部分核酸,雜合探針在製作的過程中,並不會使用一般聚合酶連鎖(PCR)反應中使用的核糖核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate;rNTP),而是會使用具有放射性、螢光或是抗原標定過核醣核苷三磷酸。如:Digoxigenin標定的核醣核苷三磷酸(DIG-rNTP)為目前最常被使用的類型。
由於抗體本身無法呈色,所以一般呈色方法通常透過鹼性磷酸酶(Alkaline phosphate)結合抗體進行染色。因為鹼性磷酸酶的受質5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate(BCIP)會被環境中的氧氣或是Nitro blue t...
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