引子合成Primer Synthesis | 合法醫療器材資訊網
![引子合成Primer Synthesis](https://i.imgur.com/6y29Lx7.jpg)
百力使用DenaturingPAGE分析合成引子的片斷,以Urea作為變性劑使合成引子於電泳時維持直線的構形,引子在電泳膠片上的移動距離跟分子大小成反比。輔以 ...
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客製化引子合成由 3-端第一個鹼基開始,根據輸入的序列,由 3- 端往 5-端逐一加入下一個鹼基,與自然界 DNA 合成的方向恰巧相反。自動化合成儀中不同的鹼基試劑會放在不同的位置,根據電腦指令執行,將指定的鹼基由獨立的管路注入反應槽中。因此不像自然界以模板合成的 DNA,會發生結合錯誤序列的狀況。然而鹼基加入的結合效率,會受到化學藥劑活性、純度之影響,因此每一生產批次有不同的結合效率。舉例而言,當結合效率為 99%,每 100 條合成的引子,就有 1 條引子無法加上該鹼基,此時下一個化學步驟會將該引子終止合成,因此會發生鹼基缺失 (deletion)。合成的產物其實是混合物,混雜了不同大小的片段,品管之目的即在確定合成引子的片段大小與純度。現行商用合成引子的品管方法有 MASS、PAGE 及 HPLC。
Bioneer 品管系統為 MALDI-TOF MASS以確認合成引子分子量大小,分析誤差介於 0.2%~0.6%,全自動化品管系統可以判斷合成失敗的小片段引子、未完全移除保護基以及酸解造成的嘌呤鹼基脫落等等合成異常之產物。 百力使用 Denaturing PAGE 分析合成引子的片斷,以 Urea 作為變性劑使合成引子於電泳時維持直線的構形,引子在電泳膠片上的移動距離跟分子大小成反比。輔以分子量標準品即可比對合成引子的片段大小。選用適當濃度的acrylamide gel, 80 mer 以下的合成引子在電泳膠片上的解析度可以達 1 mer。分子量大的合成引子 (45mer 以上),MASS 分析失去解析度,此時 PAGE 成為較適當比對分子量的工具。
上述兩種品管方法皆可確認合成引子的大小,若要確認合成引子中,完整全長的引子比例,則需要以 HPLC 分析處理。百力的 HPLC 系統為 IP-RP HPLC (ion-pairing reversed-phase HPLC),管柱藉著吸附在表面上帶正電的 ion-pairing reagent 與引子上帶負電的磷酸根結合而使引子滯留在管柱上,隨後再以疏水性漸增的溶液將引子沖提出來。由於引子與管柱的結合力與引子骨...
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